Dijagnostika tuberkuloze - naše mogućnosti i stremljenja
DIAGNOSTICS OF TUBERCULOSIS - OUR STATE OF THE ART AND MODERN APPROACHES
SAŽETAK
Tuberkuloza je zarazna bolest koju izaziva Mycobacterium tuberculosis complex i njegova izolacija u bolesničkom materijalu je "zlatni standard" za postavljanje dijagnoze.
Sem bakterioloških testova dijagnoza se može postaviti na patohistološkim analizama pri čemu nalazimo granulome sa kazeoznom nekrozom,a naknadnim bojenjem i/ili kultivacijom na podlozi dijagnoza može biti konačna.
Poboljšanje dijagnostike postiže se novijim i skupljim bakteriološkim i imunološkim metodama koje nisu dostupne svim laboratorijama.
Rad prikazuje četvorogodišnju prospektivnu studiju koja analizira dijagnostiku tuberkuloze u našim uslovima; takođe teoretski razmatra nove dijagnostičke mogućnosti koje se primenjuju u velikim laboratorijama.
Ključne reči: tuberkuloza, dijagnostika
Mr sc. med Darinka Kukavica, Odeljenje za novootkrivenu tuberkulozu, Instituta za plućne bolesti, Sremska Kamenica
SUMMARY
Tuberculosis is an infectious disease induced by the Mycobacterium tuberculosis complex and its isolation from a patient's material is considered a "golden standard" for the diagnosis establishment. Besides by bacteriological tests, the diagnosis of tuberculosis may be established by the histological analysis, providing the finding of granulomas with caseous necrosis. Additional staining and/or cultivation may provide the definite diagnosis.
Diagnostic improvements are achieved using the latest and much more expensive bacteriological and immunological diagnostic methods, unfortunately not available at all laboratories. This is a four-year prospective study which reviews and analyses the diagnostic methods for tuberculosis having been applied in our hospital, but also gives a theoretical survey of the latest diagnostic opportunities available at large laboratories.
Key words: tuberculosis, diagnostics
UZROČNIK TUBERKULOZNE INFEKCIJE
Tuberkulozu izaziva Mycobacterium tuberculosis complex i njegova izolacija u bolesničkom materijalu je "zlatni standard" za postavljanje dijagnoze. U Tabeli 1 je prikazana porodica mikobakterija koje mogu izazvati bolesti kod ljudi i onih koji su uobičajeni saprofiti.
| Mikobakterije koje izazivaju humane bolesti | |
| Mycobacterium tuberculosis complex | M. tuberculosis |
| M. bovis | |
| M. africanum | |
| Mycobacterium avium compleks | M. avium |
| M. intracellulare | |
| Mycobacterium scrofulaceum | |
| Mycobacterium kansasii | |
| Mycobacterium genevense | |
| Mycobacterium xenopi | |
| Mycobacterium szulgai | |
| Mycobacterium malmoense | |
| Mycobacterium haemophilum | |
| Mycobacterium marinum | |
| Mycobacterium ulcerans | |
| Mycobacterium leprae | |
| Mycobacterium fortuitum-chelonae complex | M. fortuitum |
| M. chelonae | |
| Uobičajene saprofitne mikobakterije | |
| Mycobacterium gordonae | |
| Mycobakterium terrae complex | |
| Mycobakterium flavescens | |
| Mycobacterium smegmatis | |
Centar za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC-the Centres for disease Control and Prevention) je 1985. godine dao definiciju slučaja tuberkuloze pri čemu je najvažniji kriterijum pronalaženje Kochovog bacila u bolesničkom materijalu. Međutim, prisustvo acido-alkoholno rezistentnih bacila direktnom mikroskopijom u bolesničkom materijalu nije dovoljan kriterijum za postavljanje dijagnoze tuberkuloznog oboljenja pre svega zbog mogućnosti da su u pitanju promene izazvane MOTT bacilima (Mycobacteria other then tuberculosis) (1,2). U Tabeli 2. su prikazane sličnosti i razlike između ove dve grupe bakterija i bolesti koje izazivaju.
| Sličnosti | Razlike |
| Morfologija mikroorganizma | Infekcioznost |
| Kliničke karakteristike | Biohemijske karakteristike |
| Radiološki nalaz | Molekularna genetika |
| Histopatološki nalaz | Oseljivost na lekove |
|
|
Patogeneza |
|
|
Odgovor na tretman |
|
|
Efekat preventivne terapije |
DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE
Direktna mikroskopija se vrši nakon bojenja bolesničkog materijala po Ziehl-Neelsenu ili fluorohromima i homogenizacije. Senzitivnost i specifičnost ove metode je visoka ukoliko se u uzorku na đe više od 10.000 bacila u mililitru, pri čemu je najbolji uzorak sputum bolesnika. Ova metoda je značajna i za praćenje efekta terapije, odnosno vremena potrebnog za postizanje konverzije sputuma.
Posle direktnog mikroskopiranja bolesničkog materijala rade se testovi kultivisanja mikobakterija, pri čemu se mogu koristiti standardne podloge (najčešće čvrste Loenstein-Jensenova). Za identifikaciju je neophodno 4 do 8 nedelja. Nakon toga se rade testovi osteljivosti bacila na antituberkulotike za koje je potrebno još tri nedelje. Ova metoda je visokospecifična i visoko senzitivna. Osnovni nedostatak ove tehnike je dužina vremena potrebnog za dobijanje rezultata.
Poboljšanje dijagnostike se ostvaruje novom radiometrijskom metodom gde se za kultivisanje koriste Bactec 460 podloge, pri čemu se detektuje prisustvo mikobakterija na osnovu njihovog metabolizma a ne vidljivog rasta. Ovom metodom sem kultivisanja mikobakterija može se brzo uraditi i ispitivanje njihove osetljivosti na lekove (tzv. testovi rezistencije). Rezultati se dobijaju za 10 do 12 dana. (3)
Druga tehnika za brzu dijagnozu tuberkuloze je gasna hromatografija gde se identifikacija vrši na osnovu lipidnog sastava mikobakterija. Ovo je osetljiva i brza metoda ali se još ne koristi za rutinsku identifikaciju mikobakterija jer je skupa i nije standardizovana. S druge strane, i nespecifičnost tuberkulostearinske kiseline (prisutna je i kod mikroorganizama iz roda Actnomycetales) ograničava njenu primenu. Reakcijom lančane polimerizacije-PCR (polymerase chain reaction) otkriva se prisustvo DNA mikobakterija u uzorku a za to je potrebno 5 do 6 časova. Negativna strana ove probe jeste njena senzitivnost od samo 70% za direktno negativne pacijente kao i nemogućnost razlikovanja mrtvih od živih mikobakterija (4).
DNA fingerprinting omogućava identifikaciju mikobakterija putem hibridizacije njihove DNA sa poznatim, obeleženim genskim sekvencama. U epidemiološkom smislu to nam može pomoći u pronalaženju izvora zaraze (5).
Mikobakterije su bogate antigenima koji stimulišu produkciju antitela i limfokina. Serološki testovi kao što su ELISA i radioimunoesej još nisu našli svoje mesto u dijagnostici tuberkuloze zbog niske senzitivnosti i specifičnosti. (6)
Sem bakteriološkim testovima, dijagnoza tuberkuloze se može postaviti patohistološkom analizom pri čemu u uzetom materijalu nalazimo granulome sa kazeoznom nekrozom a naknadnim bojenjem mogu se videti acido-alkoholno rezustentni bacili. Kultivisanjem uzetih materijala na podlogama dijagnoza može biti definitivna.
MATERIJAL I METODE ISTRAŽIVANJA
Rad u celini ima prospektivan karakter. Obuhvata 240 ispitanika koji su hospitalizovani u Institutu pod sumnjom na tuberkulozu plućne ili vanplućne lokalizacije.
Bakteriološki parametri su dobijeni od Zavoda za bakteriologiju Instituta sledećim pregledima:
- Direktnom mikroskopijom sputuma i drugih bolesničkih materijala;
- Kultivisanjem na Löwenstein - Jansen-ovim podlogama;
- Patohistološka dijagnoza je postavljena nakon bronhoskopije, pleuroskopije ili hirurške intervencije;
- Dobijeni rezultati su prezentovani tekstualno, tabelarno i grafički.
REZULTATI ISTRAŽIVANJA
Tuberkuloza pluća je dijagnostikovana direktnim pregledom sputuma kod 177 pacijenata, kulturama kod 208 pacijenata, PH pregledom kod 26 i klinički kod 12 pacijenata. Tuberkuloza pleure je dijagnostikovana kulturama pleuralnog punktata kod 4 pacijenta a PH nalazom kod 10 pacijenata. Tuberkuloza pluća i pleure je dijagnostikovana kulturama kod 3 pacijenta. Ekstrapulmonalna tuberkuloza je dijagnostikovana kod 3 pacijenta PH metodom.
| Dijagnoza TBC-a | Pluća (br.pacijenata) | Pleura (br.pacijenata) | Pluća i pleura (br.pacijenata) | Ekstrapulmonalna (br.pacijenata) |
| Direktno | 177 | |||
| Kulture | 208 | 4 | 3 | 0 |
| PH | 26 | 10 | 0 | 3 |
| Klinički | 12 |
Od 238 pacijenata kod kojih je dijagnostikovana TBC pluća kod 177 pacijenata je TBC dijagnostikovana direktnim pregledom sputuma (74,37%), kod 211 pacijenata je TBC pluća dijagnostikovana kulturama sputuma (88,66%) a od 17 pacijenata sa tuberkuloznim pleuritisom 7 je imalo pozitivne kulture (41,18%). Kod ostalih pacijenata TBC je dijagnostikovana PH pregledom.
direktnim bojenjem sputuma
pluća kulturama sputuma
i biopsije (u odnosu na ukupan broj pacijenata obolelih od TBC pleure)
DISKUSIJA
Tuberkuloza je zarazna bolest koja se širi u najvećem broju slučajeva kapljičnim putem. Cilj nam je otkriti izvor zaraze da bi otpočeli lečenje i na taj način sprečili dalju transmisiju bolesti. Prema preporukama Svetske zdravstvene organizacije rana dijagnoza tuberkuloze podrazumeva bakteriološku potvrdu, odnosno izolaciju bacila Koch-a u sputumu ili drugom bolesničkom materijalu. Drugi načini dijagnostikovanja su patohistološke analize. Ukoliko je u pitanju tuberkuloza pluća najčešće se bronhoskopijom uzima isečak sluznice bronha ili transbronhijalnom biopsijom samo alveolarno tkivo. Patohistološki nalaz karakterističan za tuberkulozu je prisustvo limfocita, epiteloidnih ćelija, histiocita i Langhansovih džinovskih ćelija koje formiraju granulome u čijem centru se nalazi kazeozna nekroza. Naknadnim bojenjem po Ziehl-Neelsenu mogu se naći acidoalkoholno rezistentni bacili. Kultivisanjem na Lowenstein-Jansenovim ili drugim podlogama dijagniza je definitivna. Na ovaj način se pregledaju i drugi patohistološki materijali koji su uzeti pleuroskopijom, biopsijama žlezda i drugih tkiva (5,7).
Standardne bakteriološke metode su veoma senzitivne i specifične ukoliko se materijali uzmu na adekvatan način i u dovoljnom broju (najmanje tri sputuma, odnosno šest uzoraka bolesničkog materijala u toku šest uzastopnih dana) (8).
Naša studija pokazuje da je od 238 pacijenata koji su imali radiološke promene na plućima tuberkuloza dijagnostikovana direktnom mikroskopijom sputuma u preko 74% slučajeva. Kultivacijom je dijagnoza potvrđena u 88,66% obolelih. Ranije studije rađene u Institutu pokazuju manji procenat direktno BK pozitivnih (oko 45%) s tim da su rezultati postavljanja dijagnoze kulturama sputuma visoki - oko 97% obolelih (88). Visok procenat direktnom mikroskopijom BK pozitivnih bolesnika može se objasniti većom zastupljenošću ekstenzivnih i kavernoznih formi tuberkuloze, dovoljnim brojem uzetih sputuma i svakako boljom obučenošću osoblja u laboratorijama. Niska senzitivnost, po američkim autorima aproksimativno oko 50% direktnom mikroskopijom pregledanih sputuma, pokušava se prevazići dodatnim imunološkim dijagnostičkim metodama, kao što su transcription mediated amplification (TMA, Gen-Probe) i polymerase chain reacion (PCR) (9,10).
Serološki ELISA testovi su nedovoljno osetljivi i specifični te se mogu primeniti kao dodatna dijagnostika kod vanplućne i latentne tuberkuloze naročito HIV pozitivnih pacijenata. (11)
Savremenu radiometrijsku metodu (BACTEC) za brzo određivanje prisustva mikobakterija u bolesničkom materijalu za sada koriste samo velike laboratorije. Ovom metodom se određuje količina obeleženog ugljenika iz podloge koji je metabolizmom mikobakterija prešao u ugljen dioksid. Široka primena BACTEC-metode za sada je ograničena iz ekonomskih razloga. Međutim, zbog visoke senzitivnosti, specifičnosti i brzine dobijanja rezultata sigurno će u budućnosti naći svoje mesto u rutinskoj dijagnostici tuberkuloze (12).
ZAKLJUČAK
Osnovna dijagnostika tuberkuloze podrazumeva nalaz bacila u bolesničkom materijalu (najčešće sputumu) direktnom mikroskopijom čime se otkrivaju najzarazniji bolesnici. Klasične metode kultivisanja na čvrstim i tečnim podlogama zahtevaju vreme, te je neophodno ubrzati dijagnostiku savremenim radiometrijskim (Bactec), imunološkim i serološkim testovima. Invazivnu dijagnostiku - bronhoskopiju i druge endoskopske metode potrebno je primenjivati samo kod nejasnih i bakterioloških negativnih slučajeva.
LITERATURA
- Davidson PT. The diagnosis and management of disease caused by M. avium complex, M. kansassi and other mycobacteria, Clin Chest Med 1989; 10: 431-43.
- Wolinsky E: Nontuberculosis mycobacteria and associated diseases. Am Rev Respir Dis 119, 107-59 (1979).
- Middlebrook G, Riggiardo Z, Tigertt WD. Automatable radiometric detection of growth of M tuberculosis in selective media. Am Rev Respir Dis. 1977; 115: 1066-9.
- Miller N, Hernandez SG, Cleary TJ: Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and PCR for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens. J Clin Microbiol 1994; 32: 393-7.
- Seaton A, Seaton D, Leitch AG: Crofton and Douglas Respiratory Diseases, fourth edition, Blackwel Scientific Publications, Oxford, 1989.
- Daniel TM, Debanne SM. The serodiagnosis of tuberculosis and other mycobacterial diseases by enzyme-linked immunosorbent assay. Am Rev Resp Dis 1987;135:37-1151.
- Crofton J, Horne N, Miller F.Clinical tuberculosis. EL BS edition. The Macmillan press LTD, London and Basing stoke, 1994; 133-77.
- Rossman MD, Oner-Eyuboglu AF. Clinical presentation and treatment of tuberculosis. In A. Fishman ed. Fishman's Pulmonarydiseases and Disorders, McGr Kuruc V. Dijagnostički algoritam kod tuberkuloze. U: Pavlović S. Tuberkuloza u praksi, Institut za plućne bolesti Sremska Kamenica, Novi Sad 1997; 37-45.
- Aw-Hill 3rd ed, New York, 1998; 2438-2501.
- Clarridge JE, Shawar RM, Shinnick TM et al: Largescole use of polymerase shain reaction for detection of Mycobakterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory, J Clin Microbiol 1993; 31: 2049-56.
- Chon ED, Heifetes L, Iseman MD: Imunologic diagnosis of tubersulosis: a review. Tuber Lung Dis 2000; 80 (3):131-140.
- Harvell JD, Hadley WK, Ng VL: Increased sensitivity of the Bactec 460 mycobacterial radiometric broth culture system das not decrease the number of respiratory specimens required for a definitive diagnosis of pulmonary tuberculosis, J Clin Microbiolog 2000; 38 (10): 3608-11.